Mario é o protagonista dos jogos que levam seu nome. Ele é um descendente de italiano de Nova York que vive no Reino dos Cogumelos e está sempre pronto para ajudar Peach, a princesa e governadora do lugar, geralmente sequestrada por Bowser, o grande vilão da franquia. Seu visual é icônico com o bigode carismático, roupas vermelhas e o chapéu com o M no centro.

Apesar de muitos acreditarem que a primeira aparição de Mario foi em Super Mario Bros. de 1985, na verdade foi em Donkey Kong, jogo lançado em 1981. Na época, era chamado de Jumpman, mas já tinha o visual com o bigode e as cores vermelhas e azul como padrão.

Luigi é o irmão de Mario e, assim como o protagonista, é um encanador. Seu visual segue a mesma ideia do herói, mas com as cores verdes ao invés do vermelho. Ele é um pouco mais alto comparado a seu irmão e também tem um grande bigode. Além de acompanhar Mario em suas jornadas, Luigi tem sua própria franquia de jogos, chamada de Luigi's Mansion.

Lá Luigi encara seus medos junto de um aspirador de pó capaz de prender fantasmas e resolve mistérios de lugares mal-assombrados. Nos jogos de plataforma de Mario, o personagem se difere um pouco de seu irmão, pulando mais alto e sendo mais "escorregadio".

Princesa Peach é a governante do Reino do Cogumelo e trabalha duro para proteger todos os habitantes do local. Ela é constantemente raptada por Bowser, dando início a jornada de Mario e Luigi para resgatá-la. O visual da garota consiste de um longo vestido rosa, com uma coroa dourada e um grande cabelo loiro.

Apesar de estar presente na maioria dos jogos do Mario, a garota não foi jogável tantas vezes. Assim como Toad, a primeira vez que Peach pôde ser controlada foi em Super Mario Bros. 2, podendo flutuar por uns instantes após cada salto. Na maior parte do tempo a garota só é jogável em derivados como Mario Kart, Tênis, entre outros.

Bowser é o principal vilão de Super Mario, sendo responsável por sempre sequestrar a princesa Peach e tirar o sossego de Mario, Luigi e todos os outros integrantes do reino dos cogumelos. O vilão é uma criatura que parece um híbrido de tartaruga com dragão: quase todo amarelo, com o rosto verde e cabelos vermelhos. Ele ainda tem um casco espinhoso verde que utiliza para atacar seus oponentes.

Ele é o Rei dos Koopa e apaixonado por Peach, por isso a sequestra para tentar fazer dela sua rainha, sem muito sucesso. Mas apesar de ser o vilão de diversos jogos da franquia, Bowser não é só maldade, ajudando Mario e seus amigos em alguns jogos, como Mario & Luigi: Bowser’s Inside Story.

Toad é um dos personagens mais importantes do Reino dos Cogumelos, sempre auxiliando Peach em tudo que ela precisa. Faz parte de uma raça agênero de criaturinhas pequenas com um cogumelo na cabeça, branco com algumas bolas coloridas. Além disso, são considerado um dos protetores do reino, assim como Mario e Luigi, mas na maior parte do tempo são apenas personagens de apoio nos jogos.

Apesar disso, Toad é jogável em alguns jogos da franquia. A primeira vez foi em Super Mario Bros. 2, onde o personagem era o mais rápido do grupo, mas também tinha a menor distância de pulo. Além disso, o personagem tem uma jogo próprio, chamado de Captain Toad: Treasure Tracker, onde o jogador precisa avançar nas fases resolvendo pequenos quebras cabeças de movimentação.

Yoshi é o grande mascote da franquia de Mario, a adorável criaturinha que acompanha algumas jornadas do herói. Sua primeira aparição foi em Super Mario World, onde em momentos da fase era possível encontrar um pequeno ovo de ondenascia o pequeno dinossauro. Ofere alguns ótimo auxílios durante a jornada salvando o protagonista de um ataque fatal ou então comendo os Koopas.

Mas além de acompanhar Mario em algumas de suas jornadas Yoshi tem suas próprias aventuras em seus jogos solo. O primeiro foi lançado ainda no Super Nintendo chamado de Yoshi Island, onde a adorável criaturinha devia levar em segurança o bebê Mario para um local seguro, o protegendo de diversas adversidades. O jogo mais recente foi Yoshi's Crafted World, lançado para o Switch em 2019, trazendo várias aventuras em um mundo feito de papelão.

Rosalina é uma das personagens importantes para o universo de Mario que foi adicionada mais recentemente, aparecendo pela primeira vez em Mario Galaxy, lançado para o Wii em 2007. Ela é a guardiã do espaço do mundo de Mario. Seu visual consiste em um vestido azul, uma coroa prata e cabelo loiro com uma franja. Devido a vir de um lugar com uma gravidade bastante diferente, seu peso é bem maior do que aparenta, conseguindo rivalizar com Donkey Kong ou até o próprio Bowser.

O maior destaque de Rosalina é que ela é a mãe adotiva das Lumas, criaturinhas parecidas com estrelas que são capazes de falar. Tanto Rosalina quanto as Lumas auxiliam Mario na sua jornada para resgatar mais uma vez Peach de Bowser. A aparição mais recente da personagem foi em Mario + Rabbids: Sparks of Hope, lançado em 2022 um derivado que mistura os personagens da Nintendo com os Rabbids da Ubisoft.

Daisy assim como Peach é uma princesa, mas do reino chamado de Sarasaland onde Mario explora em Super Mario Land. Apesar de ser uma personagem muito importante da franquia, ela não está muito presente nos jogos principais da série, mas sendo destaque nos derivados como Mario Tennis, Kart, entre outros.

Daisy tem um vestido bem parecido com o de Peach só que na cor amarela, um cabelo castanho e dois grandes brincos na forma de margaridas. Além da garota comandar seu reino, ela é o interesse romântico de Luigi, aparecendo junto dele na maior parte dos jogos derivados.