A primeira aparição do Sexteto Sinistro aconteceu em 1964, na HQ anual do Espetacular Homem-Aranha. Quem dá início ao grupo é o Doutor Octopus, que perde seus tentáculos após sofrer duas derrotas contra o herói de Nova York, resultando em sua prisão. Com os tentáculos conseguindo se libertar, o vilão escapa da prisão. Em seguida, ele contacta todos os vilões conhecidos que já haviam enfrentado o Homem-Aranha, recebendo resposta de apenas cinco: Electro, Mysterio, Homem-Areia, Abutre e Kraven, o Caçador.

Apesar de se unirem, formando a primeira encarnação do Sexteto, nenhum dos vilões queria dividir a honra de matar o Homem-Aranha. Assim, eles decidiram desafiar o herói um por um, decidindo a ordem aleatoriamente. Para poder desafiá-lo, o grupo sequestra a Tia May e Betty Brant, as usando como reféns para obrigar o herói a lutar contra eles.

O plano, no entanto, não é dos mais brilhantes. Com cada um enfrentando o herói sozinho, o Homem-Aranha consegue derrotar todos os membros do Sexteto Sinistro, um de cada vez. O próprio protagonista da história debocha da decisão dos vilões enquanto luta contra Octopus, o último dos seis a ser derrotado. Com isso, o grupo acabou se separando.

Anos depois, o grupo se reuniu novamente com um chamado do Doutor Octopus. Após tanto tempo, no entanto, algumas medidas precisaram ser tomadas, já que nem todos os antigos vilões estavam disponíveis. Kraven, por exemplo, não estava vivo, e foi substituído pelo Duende Macabro. Já o Homem-Areia havia deixado a vida de criminoso para trás, e Octopus ameaçou sua família para que ele retornasse ao grupo.

O plano dele dessa vez envolvia mais cooperação, pelo menos na superfície. Na realidade, embora estivesse trabalhando com os outros antagonistas, Doc Ock planejava trair seus aliados, tomando todo o controle para si. Ao descobrir isso, os cinco outros integrantes do grupo se uniram contra seu antigo líder.

A revolta, no entanto, durou pouco, já que os vilões logo se uniram novamente em um esquema de roubo de armas que envolvia recuperar Gog, um imenso alienígena, de outra dimensão para controlar os satélites da Hydra.

Eventualmente, o Homem-Areia se volta contra o grupo, sendo transformado em vidro e estilhaçado por Octopus. Sua posição no Sexteto é ocupada por Gog, mas o antagonista com poderes de areia logo se recupera do ataque. Ele se une ao Homem-Aranha, Quarteto Fantástico, Hulk, Sonâmbulo, Motoqueiro Fantasma, Nova e outros heróis para enfrentar seus antigos aliados, atacando e quase matando o líder do Sexteto.

Além das duas versões já citadas, algumas outras formações da equipe apareceram com o passar dos anos. Algumas mantiveram o número de integrantes e repetiram alguns personagens, como a versão formada pelo Homem-Areia em retaliação a Octopus, que contava com Electro, o segundo Mysterio, o filho de Kraven, Venom e o Abutre.

Outras versões adicionam ainda mais vilões, como o grupo com sete integrantes formado pelo Duende Macabro, que contava com Escorpião, Electro, Abutre, Shocker, Besouro e Mysterio. Norman Osborn forma um grupo ainda maior, contando com doze vilões, que conta com o Camaleão, o Homem-Hídrico e o Lagarto, além de integrantes de versões anteriores e de outros vilões do Homem-Aranha.

Essas não são as únicas versões existentes da equipe, que está sempre recebendo novos integrantes nos quadrinhos. Rhino, Ciclone, Grito, Carnificina, Morbius e até mesmo o Rei do Crime já fizeram parte do grupo em uma de suas diversas variações -- nem todas com apenas seis integrantes.

Ainda que Peter Parker seja o alvo mais frequente do Sexteto, ele não é o único que já teve que enfrentá-los. Em certas histórias, os vilões se voltam contra vários outros personagens, incluindo alguns que já fizeram parte do grupo.

Kaine Parker, um clone de Peter criado pelo Chacal, se tornou um dos alvos dos antagonistas após decidir acabar permanentemente com os inimigos do Homem-Aranha. Além disso, após se tornar o Homem-Aranha Superior, o Doutor Octopus também teve que enfrentar uma formação do grupo, composta por Bumerangue, Cérebro Vivo, Besouro, Turbo e Corisco.

Os vilões do Homem-Aranha estrelaram o primeiro crossover da Marvel nos quadrinhos. Embora não tenha sido um grande evento como os que viriam depois, foi neste ponto que a tradição de colocar diversos heróis em uma história teve início.

Isso porque, na HQ anual em que o grupo é apresentado, grandes heróis da editora, como o Homem de Ferro, o Capitão América e o Thor lutam ao lado do Homem-Aranha. Eles são mais participações especiais que partes integrais da história de fato, mas as aparições tiveram papel fundamental em estabelecer o que viria no futuro, com Guerra Civil e Guerras Secretas, por exemplo.

Versões dos X-Men e dos Vingadores já trabalharam para os vilões. Na introdução do grupo em 1964, Peter precisou enfrentar versões robôs dos mutantes criadas por Mysterio para enganá-lo.

Posteriormente, o Homem-Aranha precisou enfrentar os Vingadores. Apesar de começarem lutando ao lado dele no arco de 2012, Nos Confins da Terra, o Doutor Octopus consegue controlar a mente dos Heróis Mais Poderosos da Terra. Assim, o Amigão da Vizinhança acaba precisando enfrentar o Capitão América, Gavião-Arqueiro, Mulher-Aranha e o Homem de Ferro.

Como resultado, ainda que nenhum dos grupos de heróis tenha se associado aos vilões, ambos possuem ligações com ele, tendo sido utilizados contra o Homem-Aranha.

Outra versão do Sexteto que se destaca é o Sexteto Superior. Dessa vez, a diferença no grupo não é somente sua composição. Os próprios objetivos da equipe passam a ser outros, lutando por justiça -- ainda que nem sempre de modo realmente semelhante ao que os heróis fazem.

Isso acontece em Homem-Aranha Superior, onde o Doc Ock se torna o personagem titular. Ele passa a controlar seus antigos aliados do Sexteto Original, com o Camaleão substituindo Kraven, que estava morto. Chamados de Sexteto Superior, o objetivo do grupo agora seria lutar por justiça.

Eventualmente, Octopus perde o controle sobre os outros personagens, levando esta era do Sexteto ao fim.

O Sexteto Sinistro já apareceu em várias outras mídias além dos quadrinhos. Algumas das adaptações mais notáveis são as animações do Homem-Aranha, aparecendo nos desenhos de 1994, 2008, 2012 e 2017. O Doutor Octopus e Rhino fazem parte do grupo nas quatro versões, com o restante do grupo incluindo Rei do Crime, Mysterio, Shocker, Camaleão, Escorpião, Besouro, Homem-Areia, Abutre, Electro, Lagarto, Kraven, Norman Osborn, e outros em combinações variadas de seis integrantes.

Nos filmes, nenhum projeto de levar a equipe às telonas foi concluído até o momento. Originalmente, a Sony planejava fazer isso com a franquia O Espetacular Homem-Aranha. De acordo com o produtor Avi Arad, o filme do Sexteto seria uma história de redenção, que teria início com os vilões visando matar o Homem-Aranha mas seguiria para um caminho diferente. Com o acordo entre a Sony e a Marvel para a produção de filmes do Homem-Aranha, o projeto foi deixado de lado e acabou sendo cancelado.

Atualmente, muitos acreditam que a versão live-action do grupo de vilões será apresentada no próximo filme do Homem-Aranha do MCU. Além de já ter introduzido integrantes recorrentes da equipe, como Mysterio e o Abutre, o retorno de personagens como Doutor Octopus, Electro e Duende Verde parece indicar que uma reunião de vilões do personagem irá acontecer em algum momento.

O Sexteto também apareceu em diversos jogos, passando por plataformas como o NES, os jogos mobile, e outros consoles. Mais recentemente, o grupo fez parte de Marvel Ultimate Alliance 3 e de Marvel's Spider-Man.